深入了解MALDI質譜技術在新藥研發中的應用

簡介

本文通過介紹藥物超高通量篩選（uHTS）和藥物組織分布MALDI成像兩項檢測方案，探討了近年來MALDI（基質輔助激光解吸電離）質譜技術在加速臨床前新藥研發方面的創新性應用。

越早失敗，代價越低——這是醫藥研發領域流傳的一句老生常談，多年來科學家們一直將其奉為信條。各行各業的實踐證實這一原則可以推動創新。制藥行業通常采用的做法，是利用技術和自動化來快速篩查化合物數據庫以尋找“目標”，并在研發過程盡早融合吸收、分配、代謝、排泄以及毒性（ADME/TOX）等方面的研究，從而了解藥物分布和代謝的重要細節。這種做法無疑為近年來生產率的提升做出了貢獻。2015年至2016年間新藥研究同比增長估計為11.5%，其中增長幅度最高的是臨床前階段。據報道，處于這一階段的化合物從2015年的6061種增長到2016年的6861種。（1）

基本情況

關于小分子藥物研發理想的分析工具所具備的特點，業界已有頗多論述，比如非標記定量技術，無需探針并能夠對目標分析物進行直接檢測與定量分析。另外，快速、穩健、易用、成本效益高并可實現自動化等特性也備受關注。

質譜（MS）技術在本質上滿足了上述諸多標準，并在過去幾年為MALDI MS開啟了新的舞臺。MALDI可與各種不同的質量分析器聯用，最常見的是軸向TOF（飛行時間）質量檢測器。根據分析需要也會使用MALDI與正交TOF或FT ICR（傅里葉變換離子回旋共振）等其它質量分析器組成的質譜儀。

目前，MALDI MS技術已在一系列新藥發現與開發中得到應用，幫助研究人員識別出最具前景的小分子藥物，并向“大”制藥公司所依賴的超高通量化合物篩選項目擴展。同樣，MALDI質譜成像（MSI）技術能夠幫助開發人員在進行定量全身放射自顯影法（QWBA）實驗前，了解候選化合物及其相關代謝物在組織中的空間分布和組織生理情況。從而，在決定是否對候選化合物進行下一階段研發時，幫助新藥研發人員做出明智的決定。

同樣值得注意的是，許多候選化合物會產生具有生物活性的代謝產物。這些活性代謝物可能具有與其原型藥物不同的藥理作用和藥物動力學特性。全面了解活性代謝物的特性是毒性評估的核心，也是否決某種候選化合物的頭號原因。掌握藥物代謝酶的早期信息，對設計藥物間相互作用的研究非常有價值。

MALDI質譜成像實驗流程

做MALDI成像實驗時，首先要將組織切片固定在MALDI靶板上，并在整個組織表面添加覆蓋基質，然后進行激光掃描。激光在虛擬網格的每個離散位置上轟擊掃描組織切片，獲得質譜圖。通過繪制組織上離子強度的X 和Y 坐標函數圖像，實現分析物離子成像。

彈出提示：MALDI 質譜成像（MALDI MSI）基本原理

此外，MALDI也應用于生物制藥的質量控制，以及基礎研究和臨床診斷，例如自動化的微生物鑒定。這些應用不在本文涉及的范圍之內。

先進的新技術、新工具

隨著MALDI成為新藥研發領域功能強大的技術，儀器制造商們將注意力轉向了MALDI質譜儀關鍵組件的改進。由于企業用戶尋求改善績效、降低成本和簡化研究人員工作流程，因此系統組件的改進已經成為儀器制造商們深度開發的項目。針對不同的應用項目，企業用戶的具體要求可能會不同，比如高通量篩選檢測方案關注的是速度、通量和每個樣本的測定成本等因素，而MALDI組織成像檢測方案注重的是成像的分辨率和檢測靈敏度。然而，為了滿足專項應用方案的需求，而對關鍵組件進行的改進和優化，都會全面提升MALDI質譜儀的性能和檢測方案的效率。

MALDI質譜系統的核心是以頻率10kHz運行的一種高速激光器。穩定性對于空間和質量分辨率而言都至關重要，因此，改善透鏡、反射器和檢測器等光學系統的精密度，能夠大幅度提高儀器的性能。圖1 為典型的TOF / TOF離子光學路徑。

重要的是，擴展MALDI質譜系統的性能范圍需要高速激光器。當今的尖端系統意味著需要用10 kHz的激光器，但采用10 kHz 激光器需要先解決許多技術和機械問題。例如，傳統的MALDI-TOF質譜儀的設計是激光點固定不動，樣品靶板根據激光點的位置進行移動并定位。要讓機械裝置足夠快速、準確地移動樣本以跟上高速激光器的頻率并非易事。布魯克通過擺脫傳統思維的束縛，采用固定樣品靶板的位置，而移動激光器的方法，充分實現了10 kHz激光器的潛力。

此外，在檢測器設計方面的一項成果值得注意，即在學術上廣受好評的動態和諧ParaCell ?被整合到了solariXTMXR 系統。由莫斯科俄羅斯科學院Eugene Nikolaev 教授和他的同事們共同開發的ParaCell ?創新設計技術，可以在寬質譜范圍內穩定離子回旋共振信號。在不要求高通量時，solariXTM XR 是可以獲得千萬級分辨率的質譜儀器。此外，該儀器還能在更高采集速率下提供分辨率大于250000（m/z 400 / 1s / 7T）的基準測試性能。 承載多項創新技術的solariXTM XR近乎完美的滿足復雜混合物MALDI成像的要求，是一臺迄今無可比擬的質譜儀。

當要求質譜儀以超出常規的速度進行常規分析時，快速分析面臨的挑戰包括儀器的控制、數據的采集和數據處理程序等都是需要重點考慮的因素。與傳統MALDI儀器不同的是，如今新一代質譜系統為了滿足超快的分析速度，會采用諸如并行計算線程等策略。

實踐中的創新：

為了滿足藥物超高通量篩選（uHTS）檢測方案的需求，布魯克研發人員采用上述新技術， 成功的將rapifleX MALDI PharmaPulseTM儀器打造成測樣速度比傳統儀器快20倍，性能更穩健、檢測更靈敏，質量范圍更寬的高端MALDI-TOF 質譜系統。

2016年美國質譜年會（ASMS）期間，來自英國葛蘭素史克制藥公司的Peter Marshall博士等研發人員以墻報的形式，展示了他們如何通過將MALDI-TOF質譜儀與納升液相色譜儀相結合，每周完成100萬以上樣本篩選。這項工作在配備了10 kHz激光器的布魯克MALDITOF質譜儀上進行。實驗條件：m/z 80 -400 或700 – 3500質量范圍，每個樣本的激光轟擊數為200次。該系統可在7.36分鐘內完成1536孔靶板的測定（也就是1536個樣品!）。如果要處理更龐大數量的內部候選化合物，通過簡單計算可知，分析200 萬種化合物僅需要7.85天。整個方案的穩定性評估表明，108次測定前后的結果具有良好的相關性。

圖1 - TOF / TOF 質譜（2）的離子光路

他們的結論是，uHTS（超高通量篩選）技術和方法不僅穩定，而且分析速度非常快。該小組每周測定超過100萬個樣本，并且發現即使測定超過200萬樣本也無需清洗離子源。最后，為實現更高的通量，該小組還使用6144孔板取得了類似的檢測結果。如果納入常規應用，這將使篩選200萬種化合物所需時間縮短至2.39天。

相比之下，如果需要利用MALDI質譜成像（MALDI MSI）技術探明模型組織內的藥物及其代謝產物分布，那么布魯克 solariX 質譜系統是最佳選擇。傳統的方法是通過采用定量全身放射自顯影法（QWBA）或液質聯用（LC/MS）分析法來獲取藥物分布和代謝。但兩者都存在不足。QWBA是一種功能強大的技術，所生成的數據為世界各地的監管機構所接受。但是QWBA 得到的是總放射性，其中可能包括原型藥物、代謝物、雜質和降解產物等放射計數的總和。因此，QWBA對于研究人員希望探尋藥物在體內的生化途徑和代謝機理的需求，QWBA存在嚴重的局限性。

LC/MS分析的對象是組織勻漿提取物。這項技術無法顯示任何空間信息，更為嚴重的是，可能會產生誤導。例如，如果組織中的某個分析物在局部高度集中，提取與均漿過程將會產生稀釋作用，從而掩蓋了該分析物局部高濃度的真相，而得出相對較低濃度值，有時甚至會低于檢測限。如果藥物或代謝物出現局部蓄積，通常表明該藥物可能存在毒性，測定組織勻漿提取物往往無法準確定位藥物在組織中的分布。另外，如果來自組織勻漿的某項分析物被確定具有較高濃度，研究員則可能得出錯誤的毒性結論，因為研究人員可能會認為該藥物應該是均勻分布于整個組織。

與LC/MS方法截然不同，MSI方法采用常規組織切片作為待測樣品。首先用基質覆蓋組織切片，這樣不僅可以將組織中的化合物分子提取到組織表面，而且仍然保留了這些化合物在組織中的空間關系。組織切片樣品制備就緒后， 用MALDI-TOF質譜測定。檢測結果為具有空間分辨特性的質譜圖。因為激光僅轟擊到組織切片表層的基質結晶，底層細胞特性未受影響，所以該組織切片可以通過常規的組織染色標準程序進行染色，從而得到高質量的組織影像。將組織影像結果與MALDI 質譜分子成像信息相結合，有可能實現直接測定組織獲得組織學檢測結果。

最近M. Reid Groseclose等評估了用大鼠進行的抗癌藥物達拉菲尼（DAB）腎毒性研究，認為MALDI MSI提供的信息達到甚至超過LC/MS。這項研究旨在支持推動DAB用于兒科患者。先前的研究發現在幼鼠身上出現了一些意想不到的不良腎影響。這些不良影響在成年鼠的研究中并未出現。（3）

圖 2 - 來自 PND 7-13 幼鼠腎組織切片的質譜成像圖（4）

MALDI MSI的初步試驗結果就可以確定DAB 及其代謝物在腎臟中的分布（圖2）。隨后對腎小管沉積物進行分析，提供了沉積物的化學成分，完成了達拉菲尼用于兒科治療的風險評估。這一評估較單獨采用LC/MS 分析法的結果更為完整。

結論

制藥公司正在尋求創新型方法與技術，以推動安全、有效的新藥快速投放市場。正如我們所見，MALDI技術已經對小分子藥物的研發產生了影響，不少行業分析人士相信，未來幾年這種影響還將顯著增強。MALDI技術首先應用于基礎研究，隨即在常規uHTS 和MSI 應用中證明其價值。所以頗具前瞻性的研究人員們正在對這種最新儀器設備進行投資并且拓展應用范圍，以待在藥物早期開發過程中對候選化合物獲得更多的認識和更深入的了解。

參考資料

1.Pharmaprojects 2016. Pharma R&D Annual Review of 2016

2.Castellino S, Groseclose MR, Wagner D. 2011. MALDI imaging mass spectrometry: bridgingbiology and chemistry in drug development (Internet) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22074284/[Accessed 15/12/2016]

3.M. Reid Grosclose et al, 2015. Imaging MS in Toxicology: An Investigation of Juvenile Rat Nephrotoxicity Associated with Dabrafenib Administration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26:887:898. DOI: 10.1007/s13361-015-1103-4 (Internet) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25804893 [Accessed 15/12/2016]

4.Groseclose, M.R., Laffan, S.B., Frazier, K.S. et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26: 887. doi:10.1007/s13361-015-1103-4