化妝品體外測試技術應用案例分析及展望

生物醫學研究和應用中動物實驗的減少（Reduction）、優化（Refinement）和替代（Replacement）的3R原則提出60多年來已逐漸得到普及并成為共識，技術人員也愿意關注實驗動物的福利倫理并主動實踐減少和優化的2R原則。但以替代為核心的1R原則由于投入和研發時間長難度大一直以來進展緩慢。進入21世紀后，現代生物技術的飛速發展推動毒理學測試走向現代化，替代動物實驗的1R原則進入快速軌道。歐盟關于化妝品動物實驗禁令的實施和化學品REACH法規的影響，以及之后越來越多的國家將替代動物實驗列為化妝品法規，推動了替代技術的監管認可。近年來，以美國為首推行的“21世紀毒性測試觀念與遠景”，使得大量體外新技術從基礎研究轉化為體外方法應用于皮膚生物學和化妝品領域。

程樹軍博士研究員 廣東檢驗檢疫技術中心

1. 非動物檢測方法分類

凡是利用無知覺材料（如計算機模型、體外細胞、重建組織、離體器官、低等生物等）替代活體哺乳動物的安全性與功效性的測試都可稱為體外方法。根據實驗系統和使用目的，體外方法可分為三類。

1.1. 非測試方法

非測試方法（Non-testing methods）又稱為“硅片方法”（In silico methods），廣義是指任何基于計算機開發的預測方法?；谟嬎銠C的強大功能，很多毒性測試與功效評估的計算機方法被開發出來，用于預測化合物對人體健康和環境的影響，例如定量構效關系（QSAR）分類法，交叉參照（Read-across）、毒理學閾值（TTC）和專家系統等。這些方法在經濟合作與發展組織（OECD），歐盟、美國和日本等國家和地區發展較快，例如已經有不少QSAR 模型和工具應用到化妝品毒理學安全性評估中，例如，OECD QSAR Toolbox、Toxtree、CAESAR、TEST 及HESS 等，毒性終點涉及經皮吸收、皮膚刺激、眼刺激、皮膚致敏、急性毒性、重復劑量染毒、生殖發育、遺傳和致癌等。歐盟消費者委員會（SCCS）認為針對化妝品雜質及含量極小的化妝品原料安全性評估，可以使用TTC 方法。在工業化學品領域，交叉參照作為非測試方法中的重要一員已被多個國家的管理機構所接受。我國國家食品藥品監督管理總局（CFDA）發布的《化妝品新原料申報與審評指南》中也提到：可以根據該原料理化特性、定量構效關系、毒理學資料、臨床研究、人群流行病學調查以及類似化合物的毒性等資料情況，增加或減免試驗項目。交叉參照方法也被中國新化學物質申報登記指南所認可?？偟膩碚f，中國化妝品非測試方法的限解剛起步，開發和應用與國外都還存在一定的差距，還需要更多的經驗積累和借鑒。

1.2. 替代方法

狹義的替代方法是指經過科學驗證程序證明其相關性和可靠性，用于替代傳統動物實驗并被監管機構所認可的體外方法。因此，替代方法的結果應當與預期回答的毒性終點之間建立預測關系，即體外實驗獲得的數據與體內動物效應之間建立統計學模型。如體外細胞毒性預測嚙齒類動物的急性經口毒性，在細胞活性的半數抑制濃度（IC50）與動物半數致死劑量（LD50）間建立線性關系；基于3D表皮模型的皮膚刺激方法把細胞活性與體內刺激評分建立判定關系；眼刺激的雞胚方法把血管反應與體內眼刺激建立相關關系等。替代方法驗證工作最早始于1994年成立的歐洲替代方法驗證中心（ECVAM），完成驗證的方法已超過50項。

1.3. 體外方法

廣義的體外方法既包括符合法規要求的替代方法，還包括大量應用于化妝品原料和產品安全性或功效性測試的體外方法。體外方法由體外實驗系統、實驗過程、指標及檢測方法、結果和統計方法（預測模型）等4個基本要素組成，還包括實驗原理、適用范圍等界定方法應用領域的因素。如美白劑的整合測試策略組合了酪氨酸酶抑制、B16 或人黑色素細胞生成抑制、角質細胞攝取試驗、斑馬魚測試等多個體外方法（表1），抗光老化功效的體外測試組合包括酯酶抑制方法，成纖維細胞光老化測試和三維重建皮膚模型的方法等。這類方法緊跟皮膚生物學的發展，且與檢測技術和裝備的進步密切相關，因而新技術不斷涌現、個性化方案很多，為產品的宣稱提供數據支持。

表1. 目前國內使用的體外方法

2. 化妝品體外測試新技術進展

首個法規認可的替代方法是OECD2004年發布的指南432，即3T3中性紅攝取光毒性試驗（3T3NRUPT），目前列入指南的方法已經超過20項。我國接受替代方法成為國家標準和檢驗檢疫行業標準（SN）始于2006年，累計發布標準約30項，CFDA在2016年10月吸收列入《化妝品安全技術規范》的首個替代方法是3T3 NRUPT。截止目前，OECD先后發布的替代方法已覆蓋皮膚吸收、光毒性、眼刺激、皮膚刺激、皮膚致敏、遺傳毒性、內分泌干擾等毒性終點。如目前已在國內應用的BCOP、EPIOSKIN、DPRA 等。常用于化妝品評測的體外方法如表1。

近年來，體外方法的發展呈現三個趨勢。一是研發重點轉向更復雜的毒理學領域，如皮膚致敏、肝臟毒性、生殖發育毒性和內分泌干擾等，如2016年發布的DPRA、h-CLAT。二是整合策略的開發，嘗試把單一的方法合理科學地組合使用。如已發布的眼刺激IATA，皮膚刺激IATA草案和研究中的皮膚致敏IATA。整合策略不僅考慮了現有有效的方法，還加入了QSAR、理化信息、人群暴露等。而且基于大數據的分析，可以建立從體外數據直接預測人體風險的模型。三是建立基于證據的功效測試體外方法，把大量基礎研究投入產出的方法轉化為行業可以使用的標準，并在此基礎上建立整合策略，提高功效測試數據的可重復性和科學性，滿足化妝品行業發展的需要。

3. 化妝品體外測試方法應用案例分析

體外技術首先被應用于毒性分類和產品安全性分析，使傳統以形態學觀察為主的半定量動物實驗走向以量化的生物學參數為主的體外測試，不僅提高了測試通量，而且測試結果更為客觀和具有可比性。以BCOP為例說明替代方法在化妝品及相關行業的應用。

表2. BCOP 用于市售產品的檢測

3.1. 標準BCOP方法

BCOP采用牛角膜作為實驗系統，將其固定于特定支架。檢測液體物質時，直接將樣品作用于角膜10min，然后去除受試物，恒溫條件下后孵育2h，測量濁度值和熒光素漏出量（OD值）。檢測固體物質時，直接將樣品作用于角膜4h，去除受試物后，測量濁度值和OD 值。預測模型為：體外評分（IVS）= 濁度值+15×OD值。判定依據為：IVS ≤ 3為不分類（無刺激）；IVS ＞ 3，且≤ 55為刺激性（分類2A和2B）；IVS ＞ 55為嚴重刺激性（分類1）。BCOP被列為OECD指南437，用于化學品腐蝕性/ 嚴重眼刺激性和無分類的鑒定和標識。BCOP方法的優點：完整保留角膜結構；檢測指標包括屏障功能受損和基質蛋白變性，參數全面；三維結構可直接加樣，不受測試樣品溶解性、顏色等物理性質限制；基于角膜的測試結果在眼刺激的整體評估中權重最高，在整合策略中處于核心地位；實驗方案可根據實際需要優化調整。

表3. BCOP 用于原料的檢測

3.2. 用于市售化妝品監管

表2列舉了8種市售化妝品的抽查結果，主要為眼影、眼霜、睫毛膏、沐浴液、染發劑等眼部接觸產品。根據OECD方法的判定依據，除了產品1、5、7外，其他5種產品均為輕刺激性，但動物測試均為無刺激性。說明BCOP 方法比動物實驗敏感，再分析每個產品的測試數值，發現濁度值和OD值尚有改善的空間，可以在產品開發階段調整配方，使產品達到BCOP的標準。

3.3. 用于原料、配方的優化和比較

利用BCOP的測試結果可將其用于化妝品原料篩查。對于化妝品原料A，不同供應商的測試結果存在較大差異。從表3可見，A1和A3無刺激性，可優先選擇。BCOP也可用于產品開發階段不同配方的測試，通過比較不同配方的濁度值、OD值和體外評分，確定最溫和的產品。對于數據比較高的配方，可通過降低某種物質的含量、去除某個成分或改變配合比例對配方進行優化。

3.4. 用于特殊人群和溫和產品的測試

通常認為體外評分越小的產品越溫和，因此BCOP可用于特殊人群產品的宣稱，如嬰童、女性、老人等，這些產品以低刺激性或溫和為追求目標，如某品牌兒童產品在配方研制階段的檢測結果見表4。不斷調整配方過程中，先把體外評分降到3以下，再進一步精細化工藝或配方，把OD值降到0.05左右，把濁度值降到0.1左右，使體外評分降到1以下，滿足產品溫和宣稱的要求。經過調整后的配方5和6是比較溫和的產品。

表4. BCOP 用于溫和宣稱產品的檢測

3.5. 特殊方案的BCOP方法

為了適應產品差異化競爭、溫和宣稱及特殊人群的需要，需要對標準化替代方法進行優化。BCOP 的改良方法有以下幾種：①多參數的BCOP：在濁度和OD 值之外增加組織學定量評分，把評分在3 ～ 55 的數值進行區分，目的是為了更精確的區分刺激性和了解受試物對組織結構的影響。②延長暴露時間的BCOP：把受試物的暴露時間從標準的10 min延長至20min或更長，再進行2 h 后孵育，目的是評價長時間接觸眼角膜或上皮的刺激作用。該方案常用于長期使用的護膚品/ 眼霜、駐留類產品、醫用生物材料的評估。③多重暴露的BCOP：在角膜室溫平衡30 min后開始加樣，連續3 ～ 4次暴露，每次10 min，間隔孵育30 min，最后測量濁度值和OD值。目的是了解受試樣品多次接觸角膜的刺激作用，多用于反復使用的護膚品/ 眼霜、眼部藥品、護理套裝的檢測。④延長暴露后孵育時間的BCOP：采用常規暴露（10 min），但把后孵育延長至4 h、12 h 或18 h，測量濁度值和OD值。目的是了解受試樣品單次暴露眼角膜或上皮后刺激修復作用，可用于研究含表面活性劑的物質、化妝品原料和產品、眼部藥品等的刺激性。表5是對某品牌眼藥科用藥的刺激性評估，選擇了通過三重暴露和延長時間暴露的方案，最后獲得了最優化的產品。

表5. 特殊BCOP 方法用于眼科用藥品刺激性檢測的體外評分

3.6. 用于粘膜刺激的預測

牛角膜具有上皮組織共有的結構，可將其用于粘膜（口腔、陰道）刺激和皮膚刺激性的測試。表6列舉了BCOP方法檢測不同漱口水產品的體外評分結果，可以發現大部分市售產品的粘膜刺激性能滿足BCOP 判定要求。同樣，在用BCOP 方法檢測紙尿褲不同浸提液皮膚刺激性的實驗中，選擇了常規純水浸提（A）、人工汗液浸提（B）和人工尿液浸提（C）3 種方式區分刺激性，為產品評價的開發提供了量化檢測數據。

表6. BCOP 用于口腔和皮膚刺激的檢測

總之，在標準化BCOP基礎上的特殊方案，可滿足諸如重復暴露、長時間暴露、刺激與炎癥相關性等不同目的研究的需要。單一的方法還可以與CAMVA、SIRC等方法組合，彌補單一替代方法的局限性和提高預測的準確性。

4. 化妝品體外檢測發展趨勢

4.1. 毒性測試技術國際化

我國化妝品全安性的測試會逐漸國際化，使用與國際相同或類似的方法，或使用與國際同等水平的技術。整合運用基于風險評估資料和體外測試數據，回答原料和產品安全性和功效性的問題，把體外技術應用于整個產品制造過程。

4.2. 功效性測試多元化

功效性宣稱應以安全性為前提，并應符合法規的要求。功效性的測試方法會隨著科學（如皮膚生物學、肌膚結構組學、檢測技術等）的發展而不斷豐富和完善，如二維細胞模型、3D皮膚構建、非動物測試系統、皮膚微生物組學、臨床非介入性測試設備、計算機模型、仿生技術等技術不斷成熟并大量應用于化妝品評估過程中，帶來了多元化的變革。

4.3. 多種評測技術融合

安全性與功效性的測試須體外與臨床相結合。體外測試主要用于評估原料的有效性和安全品質，特別是對于中國傳統的植物提取物，以及大量使用的化工原料，可在短時間內獲得與測試相關的生物學信息，為新原料和新產品開發提供預測。臨床測試（如志愿者）用于評估終產品的安全性與功效性，為產品的適應性和宣稱提供直接證據。二者有機結合構成產品從研發、配方、生產到上市全過程的完整證據鏈。

4.4. 標準化測試與個性測試相得益彰

法規認可的替代方法多為毒性測試的標準化方法，是產品準入并應當遵循的指南。企業內部使用的替代方法可以在標準方法的水平上提高要求，或滿足消費者述求，或追求更高的安全水平。例如本文舉例說明的BCOP方法。隨著檢測數據的積累和研究的深入，許多改進方案將被行業內提出并使用。標準化與個性化檢測將和諧共存服務于整個行業。