發酵黑參對人體成纖維細胞的抗皺作用

發酵黑參（Fermented Black Ginseng，FBG） 是由新鮮人參經過重復汽蒸和干燥加工后用酵母發酵而制成。眾所周知，FBG具有抗氧化作用。而皮膚皺紋的形成與氧化應激和炎癥反應相關。本研究的目的是使用人體成纖維細胞（HS68）確定FBG是否具有抗皺活性。根據韓國食品藥品安全局（MFDS）對具有抗皺性化妝品的功效評價指南，我們試圖闡明FBG對I型原膠原，基質金屬蛋白酶MMP-1，MMP-2，MMP-9 和金屬蛋白酶2的組織抑制劑（TIMP-2）的影響。此外，我們還使用EpiOcular-EIT試劑盒檢驗了FBG是否對眼部具有刺激作用。研究結果表明，FBG 在濃度<10μg/ml時無細胞毒性，在高達100μg/ml 的濃度下對眼睛是安全的。在人體成纖維細胞中，FBG在0.3~10μg/ml 的濃度下可以顯著（P<0.05）增強I 型原膠原的表達水平（從117.61±1.51 增加至129.95±4.47%）。與此相反，FBG 顯著（P<0.05）降低MMP-1 的表達水平（從18.41±4.95降低至27.41±3.96%）。此外，FBG 在3μg/ml時可以將TIMP-2的表達水平增加至154.55%。然而，FBG 在10μg/ml 時使MMP-2和MMP-9的表達水平分別降低至45.15和66.65%。這些研究結果表明，作為化妝品中的有效成分，FBG具有潛在的抗皺效果。

引言

皮膚具有屏障功能，可以保護內臟免受周圍環境中毒素的侵害。皮膚的基本結構分為三部分：表皮，真皮和皮下組織。表皮在最外層，主要由為形成細胞外基質（ECM）而分泌角蛋白和脂質的角質細胞，產生色素的黑色素細胞和呈遞抗原的朗格漢斯細胞（1）組成。真皮在表皮下層，由結締組織構成。它可以通過由膠原纖維，微原纖維和彈性纖維組成的ECM 為皮膚提供張力和彈性（2）。真皮下面的皮下組織由產生ECM 蛋白的成纖維細胞，消除病原體的巨噬細胞和保存體脂的脂肪細胞組成（3-8）。

皮膚老化的誘導過程十分復雜，包括內在因素（如遺傳突變，細胞代謝和激素變化）和外在因素（如化學品，毒素，污染物和紫外線（UV）輻射）（5,9-11）。皮膚的衰老主要與ECM成分的萎縮相關，包括成纖維細胞數量減少，膠原蛋白和彈性蛋白表達水平降低，膠原纖維和彈性蛋白纖維解體（12-14）。皮膚老化的臨床癥狀，如皺紋，下垂和松弛主要由膠原蛋白和彈性蛋白表達水平的變化引起（15）。表皮角化細胞和真皮成纖維細胞可以釋放基質金屬蛋白酶（MMP）。而老化或光損傷（UV 照射）的皮膚中，膠原蛋白和彈性蛋白的降解則與MMP 相關（10,14,17）。

在東亞國家，包括韓國，日本和中國，人參植物的根部可以用作傳統草藥。它具有增強身體機能，發揮神經保護作用，增強性功能和發揮抗癌作用的功效（18-22）。此外，研究者認為，人參的抗氧化和消炎作用與它對皮膚的抗老化作用相關（23,24）。人參中的藥理活性成分包括多糖，聚乙炔和人參皂苷，其中人參皂苷被認為是最重要的成分（25）。到目前為止，研究者已在人參根部鑒定出約50 種人參皂苷。通過干燥和汽蒸過程，從人參中提取出來的這些天然人參皂苷可以轉化為更穩定，更易于利用，更具生物活性的狀態（26）。

未加工的生參通過簡單的干燥過程可以加工成白參，或者為保持和改善其功效，通過汽蒸和干燥過程加工成紅參（27）。黑參由生參經過多次重復汽蒸和干燥過程（9 次）后制成（28）。使用釀酒酵母發酵的黑參可以產生更具活性的人參皂苷（29,30）。發酵黑參（FBG）與白參和紅參相比，生物活性成分和人參皂苷的含量比不同（31,32）。然而，FBG對皮膚的影響目前仍不清楚。因此，本次研究旨在確定FBG作為化妝品成分對皮膚的毒性和抗老化作用，為支持使用FBG 作為化妝品成分提供安全和有效性數據。

材料和方法

試劑

FBG從（Ginseng By Pharm Co., Ltd.，Wonju，Korea）獲取。其詳細組成信息如前人所述（26）。細胞生長所需的所有培養基均從（Gibco BRL Inc.，Franklin Lakes，NJ，USA）購買，如Dulbecco 改良的Eagle 培養基（DMEM）高葡萄糖，胎牛血清（FBS），青霉素鏈霉素和胰蛋白酶EDTA（0.25％）。3-[4,5 二甲基噻唑2 基]-2,5 二苯基四唑溴化物（MTT），視黃酸，Dulbeco磷酸鹽緩沖鹽水（D-PBS）從（Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA）購買。細胞裂解緩沖液，苯甲基磺酰氟（PMSF），MMP-9 抗體（sc-3852S），β肌動蛋白（sc-1616），辣根過氧化物酶結合的抗兔IgG（7074）和抗鼠IgG從（Cell Signaling Technology Inc.，Danvers，MA，USA）購買。聚偏二氟乙烯（PVDF）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）2 抗體（MAB 3310）從Millipore（Billerica，MA，USA）購買。所有其他試劑均為高質量試劑。

細胞培養

人體皮膚成纖維細胞（HS68）從美國標準培養物存儲庫（ATCC，Manassas，VA，USA）獲取。在恒溫37℃，5%CO2的潮濕環境中，細胞培養在10%FBS和1%青霉素鏈霉素的DMEM中。

細胞活力測定

如前所述（10），將HS68人體成纖維細胞以5×104個細胞每孔的密度接種在96孔板上，孵育48小時。48小時后，使用不同濃度的FBG（新鮮培養基中濃度分別為10、25、50、100和200μg/ml）或蒸餾水（DW：對照組）處理細胞，繼續培養48小時。隨后，向每個孔中加入200μl MTT（新鮮培養基中MTT 濃度為0.5mg/ml），然后在37℃恒溫環境中孵育3小時。之后除去MTT 培養基，并向每個孔中加入200μl 二甲基亞砜。室溫下反應10分鐘，通過在PowerWave XS酶標儀（BioTek Instruments Inc.，Winooski，VT，USA）上測量570nm處的光密度來檢測甲臜（顯色劑）產量。然后將數據表示為以DW處理的對照組為基準的活細胞百分比。

眼刺激試驗

研究使用眼部刺激試驗（OCL-200-EIT；MatTek Corp.，Ashland，MA，USA）檢驗FBG 對眼部刺激的可能性。在恒溫37℃，5%CO2 的環境中溫育過夜后，用20μl 不含Ca++ 和Mg++的D-PBS（Sigma Aldrich） 預潤濕OCL-200-EIT 30±2 分鐘。預潤濕后，將50μl FBG（10 和100μg/ml）局部涂于預潤濕的OCL-200-EIT，并溫育30±2 分鐘。然后用300ml D-PBS 沖洗OCL-200-EIT 試劑盒中的組織，用5ml 新鮮培養基浸泡，并在37℃，5%CO2 下孵育2±0.4 小時。為了測量細胞活性，將OCL-200-EIT 與MTT 溶液（1μg/ml）溫育3 小時。在提取異丙醇后，在PowerWave XS 酶標儀（BioTek Instruments Inc.）上測量570nm 處甲臜的吸光度。從2 個孔中計算每種測試物質的平均值。D-PBS 處理細胞用作對照。數據表示為以D-PBS 處理的對照組為基準的活性百分比。

I 型原膠原和MMP-1 水平的定量

本研究使用前膠原類I 型C 肽（PIP）EIA 試劑盒（Takara Bio Inc.，Otsu，Japan） 和人MMP-1 ELISA 試劑盒（Young In Frontier，Seoul，Korea） 對人體成纖維細胞中I 型原膠原和MMP-1 的表達水平進行定量。人體成纖維細胞以5×104 個細胞每孔的密度接種。48 小時后，細胞用DW（對照），不同濃度的FBG（0.3，1，3 和10μg/ml）或0.03μg/ml的視黃酸處理48小時。隨后，依照制造商說明，使用I 型PIP EIA試劑盒和人類MMP-1 ELISA試劑盒測量培養基的I型原膠原和MMP-1表達水平。數據表示為以DW處理的對照組為基準的表達百分比。

MMP-2，MMP-9 和TIMP-2 水平的定量

本研究通過蛋白質印跡分析測量MMP-2，MMP-9 和TIMP-2 的表達水平。人體成纖維細胞用DW（對照），不同濃度的FBG（0.3，1，3 和10μg/ml）或0.03μg/ml 的視黃酸處理48 小時。為提取總蛋白，將處理過的細胞與含有1mM PMSF（Cell Signaling Technology Inc.）的細胞裂解緩沖液（Cell Signaling Technology Inc.）在冰上孵育5 分鐘。孵育后，將全細胞裂解液短暫振蕩，并在4℃下以12,000 rpm 轉速離心20 分鐘。上清液儲存在-80℃。跑凝膠前，先通過Bradford 測定法測定蛋白質濃度，然后通過10%SDS-PAGE 分離全蛋白（25μg）。隨后依照制造商說明使用轉移裝置（Bio Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA） 將分離蛋白轉移到PVDF膜（Merck Millipore，Darmstadt，Germany）。PVDF 膜在封閉緩沖液（含5%w/v 脫脂乳的TBST）中溫育3 小時。初級抗體（MMP-1，1:1,000；MMP-9，1:500；TIMP-2，1:500）與轉移膜在4℃下溫育過夜。用TBST 清洗膜后，將轉移膜與第二抗體（MMP-2 和MMP-9 的抗兔IgG，TIMP-2 的抗鼠IgG 1:1,000 稀釋）在室溫下溫育2 小時（對MMP-2），或在4℃下溫育過夜（對MMP-9和TIMP-2）。之后用TBST 清洗膜后，通過辣根過氧化物酶檢測系統（Sigma Aldrich）檢測蛋白質信號。數據表示為以DW處理的對照組為基準的表達百分比。

統計分析

本研究使用Microsoft Excel 計算表達值的平均值± 標準偏差。使用方差分析以及Prism 5.01（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）中的Bonferroni's 檢驗來評估FBG 處理前后蛋白質表達差異的統計顯著性（P<0.05 或P<0.01）。

結果

FBG的體外毒性

本研究分別使用人體皮膚成纖維細胞（HS68）和眼部刺激試驗（OCL-200-EIT）評價FBG對皮膚和眼睛的體外毒性。當HS68細胞分別用10，25，50，100和200μg/ml 的FBG 處理48小時后，細胞活性分別為96.17±6.36，93.68±5.64，94.64±4.66，90.31±4.97和88.01±3.87%。與對照組（ 不使用FBG 處理）相比，僅有經10μg/ml的FBG 處理過的細胞在細胞活性方面沒有表現出任何顯著差異（P>0.05）（圖1A）。EpiOcular-EIT結果表明，與對照組（PBS 處理）相比，10和100μg/ml 的FBG不會引起潛在的眼部刺激（圖1B）。這些結果表明，濃度<10μg/ml的FBG不具有細胞毒性。與此同時，FBG在濃度高達100μg/ml時不會引起眼部刺激。

圖1. （A）FBG 的細胞毒性。用DW 或FBG（10-200μg/ml）處理人體皮膚成纖維細胞（HS68）48 小時，并通過MTT 測定法測定細胞活性。數據是3 個單獨試驗的平均值± 標準偏差值。使用變量分析法將每個
數據與對照值進行比較，隨后進行Bonferroni's 檢驗（**P<0.01）。（B）使用OCL-200-EIT 在不同濃度FBG（10μg/ml 和100μg/ml）下進行體外眼部刺激試驗。D-PBS 為對照。FBG：發酵黑參；DW：蒸餾水；OCL-200-EIT：眼部刺激試驗；D-PBS：Dulbeco's 磷酸鹽緩沖鹽水

FBG對膠原生成的影響

為檢驗FBG對皮膚中膠原合成的影響，本研究用無細胞毒性濃度的FBG處理成纖維細胞。研究結果顯示，經過0.3，1，3 和10μg/ml的FBG處理過的細胞與對照組（無FBG 處理）細胞相比，I 型前膠原產量顯著（P<0.05）增加，分別增至117.61±1.51，122.62±2.69，128.07±5.76 和129.95±4.47%。陽性對照組，經0.03μg/ml的視黃酸處理過的細胞與對照組（無FBG 處理）細胞相比，I型前膠原產量顯著增加（P<0.05）至120.88±5.82%（圖2）。

圖2. FBG 對人體成纖維細胞中I 型原膠原的影響。用DW（Con：對照）， MMP 表達水平的RA（0.03μg/ml 視黃酸）或FBG（10-200μg/ml）處理人體成纖維細胞48 小時，并使用Procollagen Type IC Peptide（PIP）EIA 試劑盒測量I 型原膠原的表達。數據是3 個單獨試驗的平均值± 標準偏差值。使用變量分析法將每個數據與對照值進行比較，隨后進行Bonferroni's檢驗（**P<0.01）。FBG：發酵黑參；DW：蒸餾水

FBG對MMP的影響

隨后，我們分析了經FBG 處理的HS68 成纖維細胞中與膠原降解相關的MMP表達水平。研究結果顯示，經濃度為0.3，1，3和10μg/ml的FBG處理過的細胞與對照組（無FBG 處理）細胞相比，MMP-1 表達水平顯著（P<0.05）降低，分別降低至18.41±4.96，19.35±6.39，21.53±7.81 和27.41±3.96%。陽性對照組，經0.03μg/ml的視黃酸處理過的細胞與對照組（無FBG處理）細胞相比，MMP-1表達水平也顯著（P<0.05）降低至37.78±7.71%（圖3）。另外，經濃度為0.3，1，3 和10μg/ml 的FBG處理過的細胞與對照組（無FBG 處理）細胞相比，MMP-2和MMP-9的表達水平分別為76.32，74.28，52.71 和45.15%以及106.66，100.00，90.53和66.65%。陽性對照組，經0.03μg/ml 的視黃酸處理過的細胞與對照組（無FBG處理）細胞相比，MMP-2和MMP-9的表達水平降低24.18%和41.07%（圖4）。這些結果表明，MMP 的表達水平依賴FBG劑量而受其抑制。MMP 表達水平的降低可能與I型前膠原產量的增加相關。

圖3. FBG 對MMP-1 在人體皮膚成纖維細胞中的影響。用DW（Con：對照），RA（0.03μg/ml 視黃酸）或FBG（0.3×10μg/ml）處理人體皮膚成纖維細胞48 小時。使用人MMP1-ELISA 試劑盒測量MMP-1 的
表達水平。數據是3 個單獨試驗的平均值± 標準偏差值。使用變量分析法將每個數據與對照值進行比較，隨后進行Bonferroni's 檢驗（**P<0.01）。FBG：發酵黑參；DW：蒸餾水；MMP1：基質金屬蛋白酶1

FBG 對TIMP-2的表達的影響

本研究在經FBG 處理過的HS68細胞中檢查TIMP-2表達水平。經濃度為0.3，1，3和10μg/ml的FBG處理過的HS68細胞與對照組（無FBG 處理）細胞相比，TIMP-2 的表達水平分別增加至122.66，137.45，154.55 和126.76%。陽性對照組，經0.03μg/ml的視黃酸處理過的細胞與對照組（無FBG 處理）細胞相比，TIMP-2的表達水平增加至143.06%（圖5）。這些結果表明，FBG 可以增加TIMP-2的表達水平，從而引起對MMP 的抑制。

圖4. FBG 對人體皮膚成纖維細胞中MMP-2 和MMP-9的影響。用DW（Con： 對照），RA（0.03μg/ml視黃酸） 或FBG（0.3×10μg/ml）處理人皮膚成纖維細胞48 小時， 并通過Western 印跡分析測量MMP-2
和MMP-9的表達，歸一化為β 肌動蛋白的表達。FBG：發酵黑參；DW：蒸餾水；MMP：基質金屬蛋白酶

討論

人參皂苷是人參藥理活性成分的主要部分（25）。根據化學結構，人參皂苷可以分為原人參二醇，原人參三醇和齊墩果皂苷（33）。前人研究報道，人參皂苷的20-O-b-d- 吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參二醇（化合物K）在體內具有抗轉移，抗血管生成和抗過敏的活性（34,35）。具體來說，皮膚皺紋和干燥癥可以通過局部施用化合物K 來改善。化合物K 能夠在人體角質形成細胞中誘導透明質酸合酶2，以及增加老年無毛小鼠皮膚中的透明質酸含量（36）。此外，人體皮膚表面的皺紋可以通過I 型原膠原表達水平升高（37）的紅參提取物來改善?？傮w來說，這些數據表明，局部施用人參提取物可以增強人體皮膚的抗皺效果。

FBG提取物經過更復雜的加工處理（重復汽蒸，干燥，并使用釀酒酵母發酵），與新鮮人參，白參和紅參相比，可呈現不同的人參皂苷組成（38,39）。研究認為，這些差異能夠增強其抗氧化和清除自由基的活性（29,40-42）。然而，FBG提取物的抗皺效果尚未在人體皮膚上研究。本次研究中，FBG提取物顯著增加人體成纖維細胞中I型原膠原的表達水平。該結果表明，FBG提取物通過增加人體皮膚中的I 型原膠原表達水平而具有抗皺效果。

圖5. FBG 對人體皮膚成纖維細胞中TIMP-2 的影響。用DW（Con ：對照），RA（0.03μg/ml 視黃酸）或FBG（0.3μg/ml）處理人體皮膚成纖維細胞48 小時，并通過蛋白質印跡分析測量TIMP-2 的表達水平，
β 肌動蛋白的表達。FBG：發酵黑參；DW：蒸餾水；TIMP-2：金屬蛋白酶2 的組織抑制劑

I型膠原蛋白是皮膚結締組織中最豐富的蛋白質。它與其他類型的膠原蛋白（III，V 和VII），彈性蛋白，蛋白多糖，纖連蛋白和其他ECM 蛋白共同維持皮膚結構（43）。I型原膠原在人體真皮成纖維細胞中合成并分泌到真皮細胞外空間，并在其中進行蛋白水解。最后，I型膠原形成膠原束（纖維束），與其他ECM 蛋白共同維持皮膚的彈性（5,13）。原纖維（I型和III型）膠原可以減少老化和光損傷的皮膚（14,44,45）。I型膠原的降解與需要鋅的內切蛋白酶家族MMP 密切相關，MMP 可以降解ECM 所有組分（46）。具體來說，MMP-1 誘發I 型和III 型纖維膠原的降解，而MMP-9進一步降解膠原酶產生的膠原片段（44）。MMP-2和MMP-9 可以共同作用切割彈性蛋白，IV 型膠原和幾種ECM分子，而MMP-2 可以消化I，II和III型間質膠原（47）。前人研究表明，MMP-1 直接參與I 型前膠原的還原反應。MMP-2 和MMP-9 同時調節I 型前膠原的表達（47,48）。目前，所有已知的MMP 均被4 種同源TIMP 抑制（49）。其中，TIMP-2 通過直接抑制金屬蛋白酶，包括MMP-2（50）抑制幾種組織中的ECM 蛋白水解。也有研究認為，TIMP-2 通過與MMP-14 結合以激活MMP-2（50,51）。在本次研究中，FBG 提取物顯著抑制人體成纖維細胞中MMP-1 的表達。MMP-2 和MMP-9 的表達水平依賴FBG 劑量而受其抑制。此外，經FBG 處理過的細胞中TIMP-2的表達總體呈現增加的趨勢。總而言之，研究結果表明，FBG提取物可以通過抑制MMP-1，MMP-2 和MMP-9 從而誘導I 型原膠原的表達水平增加。FBG 對MMP 的抑制可能與FBG 引起TIMP-2 表達水平增加相關。

視黃酸可以有效的減弱皮膚光損傷的臨床癥狀。它可以逆轉皮膚老化后的不良反應（14,45,52）。視黃酸可以刺激人體成纖維細胞增殖，新生膠原合成以及過期或受損膠原的降解（53）。視黃酸的主要作用與抑制MMP有關（16,17）。此外，視黃酸可以引起人體支氣管肺泡灌洗細胞中的MMP-9選擇性下調以及TIMP-1的同時上調（54）。視黃酸還可以降低人體乳腺癌細胞中MMP-2的表達，這表明MMP-2 的抑制可能由上調的TIMP-2水平引起（55）。本次研究中，用視黃酸處理過的人體成纖維細胞與用FBG 處理過的細胞類似，這些細胞具有相似的I 型原膠原，MMP-1，MMP-2，MMP-9 和TIMP-2 的表達水平。這些結果表明，FBG對人體皮膚的抗皺作用機制可能和視黃酸的作用機制類似。

綜上所述，我們的體外真皮試驗研究表明，FBG處理過的細胞中I 型原膠原表達水平增加。此外，我們通過使用人體成纖維細胞和視覺組織評估了FBG的無毒性濃度。最后，我們證明FBG可以作為具有抗皺功效的安全的化妝品成分。

參考文獻請見：DOI:10.3892/ijmm.2017.2858