HPLC法測定蛋糕中丙酸鈣含量的不確定度評定

丙酸鈣作為防腐劑可以添加在焙烤類食品中，限量為2.5g/kg( 以丙酸計)。高效液相色譜法(HPLC) 是測定食品中丙酸鈣的國家標準方法。測量不確定度是與測量結果相聯系的參數，用于表征合理地賦予被測量之值的分散性。當測量結果處于臨界值時食品檢驗機構必須進行測量不確定度評定。本文對HPLC法測定焙烤類食品( 蛋糕) 中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定，計算出不確定度并報告了結果。

1 儀器、試劑

1.1 儀器

1) 高效液相色譜儀，島津LC-20A 附紫外檢測器和自動進樣器；2) 高速冷凍離心機，北京雷勃爾LR10-2.4A；3) 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器KQ-100)；4) 高速組織搗碎機，上海精科DS-1；5)pH 計, 上海儀電科學PHS-3C；6) 電子天平，上海上天FA2004；7) 溶劑過濾器及0.45μm 微孔濾膜。

1.2 試劑： 分析純磷酸(H3PO4)、分析純磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]

1.3 實驗室用超純水

1.4 食品添加劑丙酸鈣純度標準物質 GBW(E)100078

2 色譜分析條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm,5μm,P.N.880975-914

流動相：1.5g/L 磷酸氫二銨溶液, 用1 mol/L 磷酸溶液調pH 為3.0( 使用時配制); 經0.45μm 微孔濾膜過濾；

流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10μL；紫外檢測器波長：214nm；

3 樣品處理與測試

3.1 依據國家標準GB 5009.120-2016 進行試驗

3.2 樣品制備：蛋糕樣品經組織搗碎機搗碎混勻后備用；

3.3 試樣處理：準確稱取由組織搗碎機混勻后的樣品5g(精確至0.0001g) 試樣至100mL 燒杯中, 加水20mL, 加入1mol/L磷酸溶液0.5mL, 混勻, 經超聲浸提10min后, 用1mol/L磷酸溶液調pH為3 左右, 轉移試樣至50mL容量瓶中, 用水定容至刻度, 搖勻。將試樣全部轉移至50mL具塞塑料離心管中, 以不低于4000r/min 離心10min, 取上清液, 經0.45μm微孔濾膜過濾后, 待液相色譜測定。

3.4 標準溶液的配制及標準曲線的繪制

3.4.1 丙酸標準貯備液(10mg/mL)：精確稱取0.3146g丙酸鈣標準品于25mL 容量瓶中, 加水至刻度；

3.4.2 標準曲線的繪制：準確吸取5.0mL標準儲備液于50mL容量瓶中, 用水稀釋至刻度, 配制成濃度為1.0mg/mL 標準工作液。再準確吸取標準工作液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 至10mL容量瓶中, 分別加入1mol/L 磷酸0.2mL, 用水定容至10mL, 混勻。其丙酸標準溶液的最終濃度分別為0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL, 經0.45μm 微孔濾膜過濾，濃度由低到高進樣分析，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

4 測量數學模型

樣品中丙酸鈣含量( 以丙酸計), 按式(1) 計算：


式中：X—樣品中丙酸鈣的含量( 以丙酸計), 單位為克每千克(g/kg)；c—由標準曲線得出的樣液中丙酸的濃度, 單位為毫克每毫升(mg/mL)；V—樣液最后定容體積, 單位為毫升(mL)；m—樣品質量, 單位為克(g)；f—稀釋倍數。

試樣中測得的丙酸含量乘以換算系數1.2569, 即得丙酸鈣含量。

計算結果保留三位有效數字。

5 根據數學模型分析，影響不確定度來源有以下幾方面

①樣品稱量引起的不確定度, ②樣品定容引入的不確定度, ③樣品平行測定引起的不確定度, ④標準系列溶液引起的不確定度, ⑤標準擬合引入的不確定度。

6 不確定度評定

6.1 樣品稱量引起的不確定度(B 類不確定度)

本試驗所用電子天平為萬分之一，最小分度值為0.1mg,由校正證書查得天平重復性標準差0.3mg，天平重復性標準差應計算為2 次。則
稱樣量為5.0026g， 相對不確定度為：Urel(m1)=u(m1)/m=0.00043/5.0026=8.6×10-5；

6.2 樣品平行測定引起的不確定度(A 類不確定度)

試驗中對同一樣品丙酸鈣的含量進行了3 次平行測定其結果分別為：1.08g/kg、1.07g/kg、1.10g/kg， 平均值X=1.08g/kg, 標準偏差


按均勻分布計算，其不確定度為kg，則相對不確定度為

6.3 樣品定容體積引入的不確定度(B 類不確定度)

6.3.1 20℃時50mLA 級容量瓶的允許誤差為±0.05mL, 按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為6.3.2 50mLA 級容量瓶重復充液2 次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差系數C 及自由度υ, 則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10^-2mL；

6.3.3 試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10^-4， 溫差變化引起體積的變化為：50×2×2.1×10^-4=0.021mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：

則樣品定容引入的相對不確定度：



6.4 標準系列溶液引入的不確定度(B 類不確定度)

6.4.1 標準儲備液引入的不確定度

6.4.1.1 丙酸鈣標準品的純度，證書上給出的純度99.7%，不確定度為0.6%，則標準物質引入的不確定度

6.4.1.2 本試驗所用電子天平為萬分之一，最小分度值為0.1mg, 由校正證書查得天平重復性標準差0.3mg，天平重復性標準差應計算為2 次。則, 稱標準品為0.3146g，則由稱量引入的相對不確定度為：0.00043/0.3146=0.0014；

6.4.1.3 標準物質稀釋引入的不確定度

6.4.1.3.1 20 ℃ 時25mLA 級容量瓶的允許誤差為±0.03mL, 按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為=0.0173mL；

6.4.1.3.2 25mLA 級容量瓶重復充液2 次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差系數C 及自由度υ, 則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10-2mL；

6.4.1.3.3 試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10-4，溫差變化引起體積的變化為：25×2×2.1×10^-4=0.0105mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：

則標準儲備液由稀釋引入的相對不確定度：

由此，丙酸鈣標準儲備液引入的不確定度為：

6.4.2 標準系列溶液由稀釋引入的不確定度

6.4.2.1 由5mL A 級單標移液管引起的相對不確定度來自三個分量

6.4.2.1.1 5mL A 級單標移液管引的容量誤差查證書為±0.015mL，按均勻分布，不確定度為

6.4.2.1.2 5mL A 級單標移液管的充液重復性引起的不確定度，重復充液兩次，用極差計算，其極差為R=0.015mL,由極差系數C 及自由度υ， 則由充液引入的不確定度為0.015/1.13=0.013mL(mL)；

6.4.2.1.3 試驗溫度變化為±2℃，水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10^-4，按均勻分布，由溫度變化引入的不確定度為2.1則5mLA 級單標移液管體積引入的不確定度為

由此，5mL A 級單標移液管體積引入的相對不確定度為0.016/5.00=0.0032

6.4.2.2 標液定容體積引入的不確定度

6.4.2.2.1 50mLA 級容量瓶體積引入的相對不確定度6.4.2.2.1.1 20 ℃ 時50mLA 級容量瓶的允許誤差為±0.05mL, 按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為=0.0289mL；

6.4.2.2.1.2 50mLA 級容量瓶重復充液2 次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10^-2mL；

6.4.2.2.1.3 試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10^-4，溫差變化引起體積的變化為：50×2×2.1×10^-4=0.021mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：

由此，50mLA 級容量瓶體積引入的相對不確定度為

6.4.2.2.2 10mLA 級容量瓶體積引入的相對不確定度

6.4.2.2.2.1 20 ℃ 時10mLA 級容量瓶的允許誤差為±0.02mL, 按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為=0.0115mL；

6.4.2.2.2.2 10mLA 級容量瓶重復充液2 次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差系數C 及自由度υ，則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10^-2mL；

6.4.2.2.2.3 試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10^-4，溫差變化引起體積的變化為：10×2×2.1×10^-4=0.0042mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：

由此，10mLA 級容量瓶體積引入的相對不確定度為：

至此，標準系列溶液由稀釋引入的不確定度：

6.4.3 標準曲線擬合引起的不確定度

采用7 個濃度水平丙酸鈣標準溶液，得出峰面積，用最小二乘法擬合，得到標準曲線Y=175471x+2485.6，本試驗對同一樣品進行了3 次測量，求得平均值，因此由標準曲線擬合帶來的標準不確定度為：

式中：SR 回歸曲線的剩余標準差，b 為斜率，p 為待測樣品的重復測定次數(p=3)，n 為回歸曲線的點數n=7，待測樣品濃度的平均值， 為回歸曲線各點濃度的平均值， 為各標準溶液濃度值。其中，

式中：A0j 為各標準溶液的實際相應值，（a+bC0j）為根據回歸曲線算出來的理論值，由上述表中數據計算出SR 回歸曲線的剩余標準差，

即：

由標準物質及曲線擬合產生的不確定度為：

B 類不確定度為

合成不確定度：

擴展不確定度： 取p=95%,kp=2, 則U=u_c ×k=0.025×2=0.05g/kg

報告結果：1.08±0.05g/kg(k=2)

不確定度表達測量結果的分散程度，是一個定量的概念，可以用定量的數字描述。本文對HPLC法測定焙烤類食品( 蛋糕)中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定，若檢測結果處于標準限量的臨界值或標準方法有要求時，必須結合不確定對檢測結果進行評判。